一、產(chǎn)品背景

在研究項目中，當(dāng)向外部來源運送樣本或從外部來源運送樣本時，或者需要在不同時間收集樣本時，或者僅僅是當(dāng)樣本不能一次全部處理時，通常需要儲存新鮮器官和固體組織樣本。在這些情況下，短期儲存可以充分靈活地在幾天內(nèi)對組織進行進一步處理。為了從儲存的組織中分離活細胞，必須避免在儲存期間出現(xiàn)壞死和凋亡。此外，必須防止細胞活化，以及細胞多能性的變化，以保持細胞的生理和功能狀態(tài)。一種常見的儲存方法是冷凍組織樣本，但這經(jīng)常導(dǎo)致解凍后的細胞死亡率很高，并且對運輸構(gòu)成挑戰(zhàn)。

為了克服所有這些問題，美天旎專門開發(fā)了MACS組織保存液，它可以在2-8°C下將新鮮固體組織最佳儲存至少48小時。在此存儲期內(nèi)，細胞的活力、功能和激活狀態(tài)得以保存，并防止細胞應(yīng)激相關(guān)基因的誘導(dǎo)。MACS組織保存液已經(jīng)過多種人類和小鼠組織的測試，包括腫瘤、肺、脾、腦和骨骼肌。

二、材料與方法

1. 腫瘤儲存

收集小鼠CT26腫瘤并切成大小相似的塊。將等量的腫瘤切片分別放入裝有5 mL MACS組織保存液的兩個15 mL試管中，于2-8℃保存24和48小時。在每個zhi定的時間點，新鮮和儲存的腫瘤片以相同的方式處理。

2. 腫瘤分離

使用帶加熱器的gentesmacs™ Octo解離器和Tumor Dissociation Kit, mouse根據(jù)說明書解離腫瘤。解離后，獲得的單細胞懸浮液使用MACS Smart Strainers(70µm)過濾。其中一部分細胞用于流式細胞術(shù)分析，其余細胞保存在RLT緩沖液(Qiagen)中，待進一步處理用于基因表達分析。

3. 流式細胞術(shù)分析

使用以下抗小鼠RE Afinity®抗體流式細胞術(shù)分析TIL群體:CD45 (REA737)、CD3 (REA614)、CD25 (REA568)、CD69 (REA937)、CD4 (REA604)、CD8a (REA601)、CD19 (REA749)、CD80 (REA983)和CD86 (REA1190)。使用MACSQuant®Analyzer 10對樣品進行分析。碘化丙啶用于排除死細胞。死細胞排除后，從門控CD45+活細胞中分析TIL群體。

4. 基因表達分析

使用RNeasy®Mini Kit (Qiagen)從新鮮和儲存的細胞中分離RNA。使用Qiagen公司的RT2第一鏈試劑盒(RT2 First Strand Kit, Qiagen)生成cDNA，并使用Qiagen公司的RT2 Profiler®PCR陣列(Stress and Toxicity PathwayFinder®，小鼠)和GeneGlobe®分析工具分析基因表達。

三、結(jié)果

MACS組織保存液可保存細胞活力和TIL群體組成長達48小時，CT26腫瘤在收集當(dāng)天或在MACS組織保存液中儲存24和48小時后處理。分離后，流式細胞術(shù)分析TILs的總細胞活力和組成。在新鮮和儲存的樣品中，細胞活力均超過85%(圖1A)。此外，TILs的組成也隨著時間的推移而保持不變(圖1B)。通過分析活化標(biāo)記CD25、CD69、CD80和CD86在特定TIL群體中的表達，發(fā)現(xiàn)細胞的活化狀態(tài)也得以保存。

圖1:CT26小鼠腫瘤在MACS組織中4°C保存

儲存液24或48 h。解離后，流式細胞術(shù)分析細胞總活力(A)和TIL組成(B)。細胞頻率參照活細胞CD45⁺。另外，CD3⁺和CD19⁺細胞子集的頻率分別指對應(yīng)的親本CD3⁺和CD19⁺群體。

在MACS組織保存液中，細胞應(yīng)激相關(guān)基因的表達被阻止，分子分析的主要關(guān)注點是儲存條件誘導(dǎo)細胞應(yīng)激和基因表達的變化。這是通過分析細胞應(yīng)激途徑相關(guān)基因的表達來研究的。將儲存樣品的基因表達與新鮮樣品進行比較。在儲存24或48小時后，細胞中未觀察到細胞應(yīng)激相關(guān)基因的表達發(fā)生重大變化，基因表達與新鮮樣品細胞相當(dāng)(圖2)。

圖2:新鮮腫瘤和儲存腫瘤細胞中細胞應(yīng)激相關(guān)基因的表達情況。從新鮮和儲存的CT26腫瘤細胞中分離RNA，分析細胞應(yīng)激相關(guān)基因的表達。熱圖顯示了與新鮮組織相比表達率的倍增變化。

四、結(jié)論

•  MACS組織保存液是一種強大而方便的解決方案，適用于不同組織樣品和器官的短期儲存。

•  細胞活力、細胞成分和細胞激活狀態(tài)可保存至少48小時。

•  最后，MACS組織保存液可以防止細胞應(yīng)激反應(yīng)，因為與新鮮樣品材料相比，細胞應(yīng)激相關(guān)基因表達水平的變化保持在最di水平。

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