原代細胞分離培養(yǎng)是一項實驗技術，它涉及從生物體中提取組織或細胞，并將它們轉移到體外環(huán)境中進行培養(yǎng)。這些來源包括各種組織器官、外周血和胚胎等。在培養(yǎng)過程中，原代細胞的生長速度相對較慢，通常在培養(yǎng)的前10代內停止生長。因此，通常將培養(yǎng)的細胞歸類為原代細胞培養(yǎng)，這些細胞包括第1到第10代的細胞。下面讓我們一起來看看原代細胞分離的注意事項與常見問題吧！
 

　　一、常見問題：
 

　　1. 保存血清好的方法是什么？
 

　　建議將血清存放在 -5℃ 至 -20℃的溫度范圍內。如果存放在4℃，請不要超過一個月。如果無法一次使用完整瓶血清，建議將血清經過無菌分裝后存放在適當的滅菌容器中，然后再放回冷凍。
 

　　2. 如何解凍血清以保持其最佳培養(yǎng)狀態(tài)？
 

　　建議將血清從冷凍箱中取出后，首先放置在2～8℃的冰箱中使其融化，然后在室溫下使其融化。但務必要注意，在融解過程中必須規(guī)律地搖晃以確保均勻。
 

　　3. 血清解凍后發(fā)現有絮狀沉淀物出現，應該如何處理？
 

　　血清中出現沉淀物有很多原因，但最常見的是由于血清中脂蛋白的變性所致。此外，血清解凍后血纖維蛋白的存在也可能導致沉淀物的生成。
 

　　1. 通過使C57BL/6小鼠頸椎脫臼死亡，然后用適量的酒精噴灑和Buffer滴加的方式，快速分離結腸。
 

　　2. 沿著腸系膜進行剪開，利用DMEM培養(yǎng)基清洗結腸，以去除其中的腸腔內容物。
 

　　3. 使用無菌剪刀將結腸組織剪成約1mm³大小的碎片。
 

　　4. 使用10 mL 0.1%膠原酶I和3%分散酶II對組織進行消化，在37℃的搖床上消化25分鐘。
 

　　5. 進行吹打混勻，并通過100μm細胞過濾器過濾，以收集上清液。
 

　　6. 采用相差消化法和差速貼壁法去除成纖維細胞。
 

　　7. 加入1 mL培養(yǎng)基，將細胞懸浮后接種于含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 

　　8. 當細胞生長至培養(yǎng)瓶的80-90%時，使用5 g/L胰酶消化液進行消化，然后將其接種于細胞培養(yǎng)板中。
 

　　二、注意事項：
 

　　原代細胞培養(yǎng)具有較高的成本，并對培養(yǎng)條件有嚴格要求。因此，在培養(yǎng)過程中需要特別注意保持無菌環(huán)境，并盡可能去除目標細胞以外的其他細胞。
 

　　1. 在實驗開始前，必須對所有器械進行消毒處理，并進行高壓滅菌，液體則需要進行無菌過濾處理。
 

　　2. 酶消化液必須立即現用現配，以確保其活性。
 

　　3. 在實驗過程中，需要充分消化組織以確保檢測到足夠數量的細胞。
 

　　4. 同時，也要盡可能充分去除成纖維細胞。
 

　　5. 在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，必須保持全程無菌操作，以確保培養(yǎng)環(huán)境的純凈性。
 

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