質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學(xué)研究中zui常用的實驗技術(shù)，原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。那么你知道質(zhì)粒構(gòu)建的過程有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、質(zhì)粒載體制備

    質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一般推薦使用雙酶切。其實目的就只有一個，盡量使載體的末端具有特異性，防止自連。

1）選擇質(zhì)粒上兩個酶切位點的距離不應(yīng)小于太小（>10bp），否則影響限制性內(nèi)切酶對切點的識別，不利于空載體的雙酶切。

2）一般目的基因用于克隆表達(dá)的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：目的基因片段內(nèi)部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）。

3）實驗后繼應(yīng)用的所有載體（真核、原核、酵母、昆蟲）都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）。（不然換載體表達(dá)時，還要重新設(shè)計引物，以引進(jìn)新的酶切位點）。

4）盡可能選比較常用的酶切位點（常用切點酶的價格比較便宜）。

5）兩個酶切點至少隔上3個堿基。

6）兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當(dāng)于單酶切。

7）最好使用酶切效率高的酶。

8）最好使用雙酶切有共同buffer的酶。

二、目的片段制備

    主要使用PCR擴增的手段，首先要對目標(biāo)片段進(jìn)行擴增富集。PCR 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是一種用于擴增復(fù)制特定 DNA 片段的常用分子生物學(xué)技術(shù)。PCR 的最大特點是能將微量的 DNA 大幅擴增，在克隆前獲得大量的目標(biāo)基因片段。

    利用引物設(shè)計軟件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在線設(shè)計引物并合成后，配制 PCR 反應(yīng)體系：將模板、引物、dNTP、酶、反應(yīng)緩沖液和 ddH?O 按比例加入，加好后輕微點離，放入 PCR 儀中擴增目的片段，擴增后通過瓊脂糖凝膠檢測目的片段大小是否正確。

三、酶切連接

    獲得目標(biāo)片段后，要與我們的質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，必須借助兩個工具來實現(xiàn)——酶切工具（限制性內(nèi)切酶）和連接工具（DNA 連接酶），這里使用的內(nèi)切酶在我們的片段和載體上產(chǎn)生的接口一定要相同，不然DNA連接酶是無法將它們連接上的。

四、轉(zhuǎn)化鑒定

    將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞（常見的感受態(tài)細(xì)胞：DH5α、BL21，他們可是轉(zhuǎn)運過程的小能手，負(fù)責(zé)質(zhì)粒的克隆和表達(dá)，這里下期科普百科會詳細(xì)介紹），冰上放置30min、42°C 熱激轉(zhuǎn)化或電轉(zhuǎn)化，加入無抗性 LB 培養(yǎng)基，200rpm -37°C 搖床搖 45-60min 后，涂至抗性或者其他篩選平板上，37°C 培養(yǎng)過夜、挑取 3-5 單個克隆搖菌、菌落 PCR 或提取質(zhì)粒后酶切鑒定、鑒定完畢后送質(zhì)?；蚓簻y序驗證。

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